DNA Amplifikasyon ve klonal seleksiyon

DNA Amplifikasyon ve klonal seleksiyon

Büyük ölçekli dizilemenin amacı, kromozom gibi çok uzun DNA parçalarını dizilemektir. Yaygın kullanılan yollardan biri büyük DNA parçalarını restriksiyon enzimleri veya mekanik güçler kullanarak küçük parçalara ayırmaktır. Parçalanmış DNA bir DNA vektörü içine klonlanır ve Escherichia coli içinde çoğaltılır. Her bir bakteriyel koloniden saflaştırılan kısa DNA parçaları ayrı ayrı dizilenir ve tek bir uzun, bitişik dizi şeklinde elektronik olarak birleştirilir.

Bu yöntem DNA dizisi hakkında bir ön bilgi gerektirmez ve de novo dizileme olarak adlandırılır. Birleştirilmiş dizideki boşluklar primer yürümesi yapılarak doldurulabilir. Farklı stratejilerin hız ve doğruluk açısından farklı avantajları vardır; saçma yöntemleri (İng. shotgun sequencing) çoğu zaman büyük genomları dizilemekte kullanılır ama elde edilen verinin birleştirmesini yapmak karmaşık ve zordur, özelikle dizi tekrarlarının neden olduğu bölgelerde.

Çoğu dizileme yönteminde bireysel DNA moleküllerinin çoğaltılması için bir in vitro klonlama adımı kullanılır, çünkü moleküler tespit yöntemleri tekil moleküllerin dizilemesine yetecek duyarlıkta değildir. Emülsiyon PCR yönteminde bireysel DNA molekülleri ve primer kaplı boncuklarlar, yağ fazı içinde bulunan sulu damlacıklar içinde izole edilir. Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) ile her boncuk DNA molekülünün klonal kopyaları ile kaplanır, sonra bu boncuklar daha sonra dizilemede kullanılmak üzere sabitlenir (immobilize edilir). Emülsiyon PCR Marguilis ve arkadaşları (454 Life Sciences tarafından ticarileştirilmiştir), Shendure ve Porreca ve arkadaşları (Poloni dizilemesi olarak bilinir) ve SOLiD dizilemesi (Agencourt tarafından geliştirilmiştir, artık Applied Biosystems bünyesindedir).

In vitro klonal çoğaltma için kullanıla bir diğer yöntem köprü PCR (İng. bridge PCR) olarak adlandırılır, bunda DNA parçaları katı bir yüzeye bağlanmış primerler üzerinde çoğaltılır (bu yöntem Illumina Genome Analyzer makinasında kullanılır). Tek molekül yöntemleri (Stephen Quake'in laboratuvarında geliştirilen ve daha sonra Helicos tarafından ticarileştirilen) bir istisnadır: bu yöntemde parlak floresan boyalar ve lazer uyarımı kullanılarak bir yüzey üzerine sabitleştirilmiş bireysel DNA moleküllerindeki baz ekleme olayları tespit edilir, böylece moleküler çoğaltma gereği ortadan kalkar.