DNA Zincir sonlandırma yöntemleri

DNA Zincir sonlardırma yöntemi nedir nerelerde kullanılır.

DNA Zincir sonlandırma yöntemi (veya Sanger yöntemi, onu geliştiren Frederick Sanger'e atfen) Maxam ve Gilbert yöntemine kıyasla daha verimli olduğu, daha az toksik kimyasal ve radyoaktivite gerektirdiği için kısa sürede hızla yaygınlaştı. Sanger yönteminin ana ilkesi zincir sonladırıcı olarak dideoksinükleotit trifosfatlar (ddNTP'ler) kullanılmasıdır.

Klasik zincir sonladırma yöntemi için tek iplikli bir DNA kalıp, bir DNA primeri, bir DNA polimeraz, normal deoksinükleotitfosfatlar (dNTP'ler) ve DNA zincir büyümesini sonladıran modifiye edilmiş nükleotitler (dideoksiNTP'ler, veya kısaca ddNTP'ler) kullanılır. Bu ddNTP'ler otomatik dizileme makinalarında otomatik olarak tespit edilebilmek için radyokatif veya floresan olarak işaretlenir. DNA numunesi dört ayrı dizileme reaksiyonu için paylaştırılır, bunlarda ortak olarakstandart deoksinükleotitler (dATP, dGTP, dCTP ve dTTP) ve DNA polimeraz bulunur.
Her reaksiyona dört dideoksinükleotit'ten bir tanesi (ddATP, ddGTP, ddCTP, veya ddTTP) eklenir. İki nükleotit arasında bir fosfodiester bağı oluşması için gerekli olan 3'-OH, dideoksinükleotitlerde bulunmadığı için bunları içeren bir DNA zinciri daha fazla uzayamayaz. Bu nedenle, çeşitli uzunluklarda DNA zincirlerinin oluşumuyla reaksiyon sona erer.

Yeni sentezlenen ve işaretlenen DNA parçaları ısıtılarak denatüre edilir ve jel elektroforeziyle büyüklüklerine göre ayrıştırılır. Dört reaksiyonun (A, C, G ve T) her birindeki DNA parçaları elektrik alanının etkisiyle jel içinde birbirine paralel ayrı yollardan (bu yollara şerit veya çizgi denir) ilerleyerek ayrıştırılır. Aynı uzunluğa sahip DNA parçları aynı hızda ilerler ve görselleştirildiklerinde (otoradyografi veya mor ötesi ile) birer bant olarak görünürler. Sağdaki resimde jelin üzerine bir röntgen filmi konmuştur, siyah bantlar belli uzunluktaki DNA parçalarına karşılık gelir. Belli bir şeritteki karanlık bant, bir dideoksinükleotitin (ddATP, ddGTP, ddCTP, veya ddTTP) zincire dahi edilmesi sonucu sonlanan bir DNA parçasıdır. Dört şeritteki farklı bantların göreceli konumlarına bakılarak DNA dizisi (alttan yukarı doğru) okunabilir.

Bir DNA parçasını işaretlemek için 1) işaretlenmiş primer, ya 2) işaretlenmiş dNTP, ya da (3) işaretlenmiş bir ddNTP kullanılabilir. (büyütmek için tıklayın)

Zincir sonlandırma dizilemesinin teknik çeşitlemeleri mevcuttur. Radyoaktif fosfor içeren nükleotitler kullanılarak radyoişaretleme yapılabilir veya 5' ucunda floresan boya ile işaretlenmiş bir primer kullanılabilir. Optik bir sistemde yapılan boya-primer dizilemesi sayesinde okuma daha hızlı ve ekonomik yapılabilir ve sistemin otomatizasyonu mümkün olur. Leroy Hood ve arkadaşları tarafından geliştirilen bu sistemler otomatik ve yüksek hacimli DNA dizilemesini mümkün kıldı.

Radyoaktif dizileme ile floresan piklerin karşılaştırması (büyütmek için tıklayın)

Zincir sonlandırması DNA dizilemesini son derece kolaylaştırmıştır. Örneğin, ticarî olarak elde edilebilen zincir sonladırma kitlerinde dizileme yapmak için gerekli olan reaktantlar, taksim edilmiş ve kullanıma hazır şekilde bulunur. Yöntemin sınırlı kalabileceği durumlar, (1) primerin DNA'ya non-spesifik bağlanıp DNA dizisinin doğru okunmamasına neden olması ve (2) DNA'daki ikincil yapıların dizinin sadakatine etki etmesidir.

Boya sonlandırmalı dizileme

Kapiler elektroforez

Boya sonlandırmalı dizilemede (İng. Dye-terminator sequencing) zincir sonladırıcı ddNTP'lerin işaretlenir, böylece işaretlenmiş primer yönteminde olduğu gibi dört reaksiyon yerine, dizileme tek bir reaksiyon içinde yürütülebilir. Boya sonladırma dizilemesinde dört dideoksinükleotit bitiricilerin her biri farklı floresan boyalarla işaretlidir, bunların her biri farklı dalga boylarında ışık salar.

Daha az işlem gerektirdiğinden ve daha hızlı çalıştığından dolayı, günümüzde otomatik dizileme makinalarının çoğunda boya sonladırma dizilemesi yapılır. Bu yöntemin bazı sınırlamaları vardır, boya işaretli zincir sonladırıcıların DNA parçasına dahil oluşunda boyadan boyaya farklar mevcuttur, bunun sonucu kapiler elektroforezde elde edilen dizi kromatogramındaki pik yükseklikleri ve şekilleri eşitsizlikler gösterir (soldaki şekle bakınız). Modifiye edilmiş DNA polimeraz enzim sistemleri ve DNA'ya dahil olmadaki çeşitliliği azaltan boyalar ile bu problem çözülmüştür. Boya sonladırma yöntemi ile otomatize edilmiş yüksek hacimli DNA dizi analiz makinaları günümüzde dizileme projelerinin büyük bir çoğunluğunda kullanılmaktadır.

Zorluklar

DNA dizilemesinde sık rastlanan sorunlar arasında ilk 15-40 baz dizisinin kötü kaliteli olması, ve 700-900 bazdan sonra dizileme kromatogramının kalitesinin kötüleşmesidir. Baz bildirim (İng. Base calling) yazılımları kalite kırpması (İng.quality trimming) için tipik olarak bir kalite değeri de verir.

DNA parçaları dizilemeden önce klonlanmışsa, elde edilen dizide klonlama vektörüne ait kısımlar da olabilir. Buna karşın, PCR-temelli klonlama ve pirodizilemeye dayalı yeni dizileme teknolojilerinde klonlama vektörü olmaz. Ampliseq ve SeqSharp gibi tek adımlı Sanger dizileme (kombine amplifikasyon ve dizileme) yöntemleri sayesinde hedef genler klonlanmadan ve önceden çoğaltılmadan hızlı dizilenebilmektedir.

Mevcut yöntemler tek bir reaksiyonda sadece nispeten kısa (300-1000 nükleotit uzunlukta) DNA parçalarını doğrudan dizileyebilmektedir. Bu limitin üzerindeki DNA parçalarının dizilenmesindeki ana engel, uzunluk farkı bir nükleotit olan büyük DNA parçaları için ayrım gücünün yetersiz olmasıdır.